FARMACOLOGIA E TOSSICOLOGIA

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Fedele E., Ricciarelli R. (2021) Memory enhancers for Alzheimer’s dementia: focus on cGMP. Pharmaceuticals 14(1), 1-14.

Il guanosin-3′,5′-monofosfato ciclico, più noto come GMP ciclico o cGMP, è un classico secondo messaggero coinvolto in una molteplicità di vie intracellulari che controllano numerose funzioni fisiologiche. Questo nucleotide ciclico è sintetizzato dalla famiglia delle guanilato ciclasi che comprende enzimi solubili e particolati, ciascuno con diverse isoforme e con differenti meccanismi di attivazione. Gli effetti del cGMP sono principalmente mediati dall’attivazione della PKG e dei  canali CNG, mentre la sua azione viene terminata in seguito all’idrolisi a GMP operata da fosfodiesterasi, sia specifiche che a doppio substrato. Nel sistema nervoso centrale (SNC), il cGMP ha attirato l’attenzione dei neuroscienziati soprattutto per il suo ruolo chiave nei fenomeni di plasticità sinaptica e, in particolare, nel potenziamento a lungo termine della trasmissione sinaptica eccitatoria alla base della formazione e del consolidamento della memoria, innescando così una “corsa all’oro” per nuovi farmaci che potrebbero essere efficace per il trattamento dei deficit cognitivi. Questa review riassume le moderne conoscenze sulla neurochimica del sistema cGMP e, quindi, passa in rassegna le sperimentazioni precliniche e cliniche di farmaci in grado di aumentare i livelli di cGMP per la terapia della malattia di Alzheimer (AD). Sebbene i dati preclinici dimostrino gli effetti benefici del cGMP sui deficit cognitivi nei modelli animali di AD, i risultati degli studi clinici effettuati fino ad oggi su farmaci in grado di aumentarne i livelli nel SNC non sono conclusivi e saranno necessari ulteriori studi su coorti selezionate di pazienti con AD, con diversi dosaggi e possibilmente indagando anche terapie combinate, per valutarne adeguatamente il potenziale terapeutico nei deficit cognitivi.

Di Giovanni G., Grandi L.C., Fedele E., Orban G., Salvadè A., Song W., Cuboni E., Stefani A., Kaelin-Lang A., Galati S. (2020) Acute and Chronic Dopaminergic Depletion Differently Affect Motor Thalamic Function. Int. J. Mol. Sci. 21(8). pii: E2734.

Sebbene il talamo motorio (MTh) giochi un ruolo chiave nella codificazione delle informazioni motorie attraverso il loop gangli della base-corteccia cerebrale, poco si sa riguardo alle sue alterazioni funzionali in situazioni patologiche come la malattia di Parkinson. A questo scopo, abbiamo esaminato gli effetti della deplezione acuta e cronica di dopamina sul firing dei neuroni nel MTh e sull’interazione funzionale tra MTh e corteccia cerebrale mediante tecniche di elettrofisiologia. Inoltre, abbiamo monitorato le concentrazioni extracellulari di glutammato e GABA nel MTh in entrambe le condizioni sperimentali mediante microdialisi intracerebrale. La deplezione acuta di dopamina è stata indotta infondendo tetrodotossina (TTX) nel fascicolo prosencefalico mediale (MFB) di ratti anestetizzati. La deplezione cronica di dopamina è stata ottenuta per degenerazione del MFB causata da 6-idrossidopamina (6-OHDA). La deplezione di dopamina acuta ha provocato una significativa inibizione del firing neuronale nel MTh senza cambiamenti dell’attività di tipo burst. Al contrario, nel modello di deplezione cronica, non si è osservata alcuna variazione della frequenza di firing ma si è avuto un aumento dell’attività di tipo burst e una alterazione dell’accoppiamento MTh-corteccia. Per quanto riguarda il rilascio di neurotrasmettitori nel MTh, la deplezione acuta di dopamina ha provocato un aumento significativo della concentrazione di GABA extracellulare e nessun cambiamento dei livelli di glutammato, mentre abbiamo osservato una riduzione significativa del GABA extracellulare e un aumento del glutammato in condizioni di deprivazione cronica di dopamina. I nostri risultati dimostrano che l’attività del MTh è effettivamente alterata dalla deplezione di DA e supportano l’ipotesi che, in caso di deprivazione cronica di dopamina, si verifichi un riequilibrio della funzione del MTh che è in grado di controbilanciare i marcati cambiamenti causati dalla deplezione acuta di dopamina.

Bonifacino T.*, Rebosio C.*, Provenzano F., Torazza C., Balbi M., Milanese M., Raiteri L., Usai C., Fedele E., Bonanno G. (2019) Enhanced function and overexpression of metabotropic glutamate receptors 1 and 5 in the spinal cord of the SOD1G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis disease progression. Int. J. Mol. Sci. 20(18). pii: E4552. *equally contributed.

L’eccitotossicità glutammatergica è una delle principali cause della Sclerosi Amiotrofica Laterale (SLA) che provoca la morte dei motoneuroni primari e secondari. In un nostro precedente studio preclinico, utilizzando topi SOD1G93A come modello murino della patologia umana, abbiamo dimostrato che i recettori metabotropi glutammatergici del gruppo I (mGluR1/5) erano in grado di indurre, a livello del midollo spinale, un rilascio anomalo di glutammato nella fase tardiva della malattia (120 giorni). Per poter capire se questo evento potesse essere causa/concausa della malattia o un suo effetto, abbiamo condotto una serie di esperimenti nella fase pre-sintomatica della malattia (30 e 60 giorni) o all’esordio della sintomatologia clinica (90 giorni). Abbiamo osservato che, nel midollo spinale, il rilascio di glutammato indotto dal 3,5-DHPG, un agonista misto mGluR1/5, risultava aumentato a 90 giorni nei topi SOD1G93A, mentre a 30 e 60 giorni non si evidenziavano differenze rispetto ad animali di controllo. La caratterizzazione farmacologica di questo effetto con antagonisti selettivi ha evidenziato che erano coinvolti entrambi i sottotipi recettoriali. Inoltre, l’espressione dei recettori mGlu1 e mGlu5 sulle terminazioni nervose glutammatergiche risultava aumentata nel midollo spinale di topi SOD1G93A a 90 giorni.

Pertanto, possiamo  concludere che, nella fase sintomatica precoce, la funzionalità e l’espressione dei recettori glutammatergici del gruppo I sono aumentate nel midollo spinale di topi SOD1G93A, causando un ulteriore aumento del rilascio di glutammato che parteciperebbe ai processi neurodegenerativi implicati nella SLA.

van Goethem N.P*., Paes D*., Puzzo D*., Fedele E*., Rebosio C., Gulisano W., Palmeri A., Wennogle L.P., Peng Y., Bertrand D., Prickaerts J. (2019) Antagonizing α7 nicotinic receptors with methyllycaconitine (MLA) potentiates receptor activity and memory acquisition. *equally contributed. Cell Signal. 62:109338, 1-8

Molteplici evidenze sperimentali hanno dimostrato come la neurotrasmissione colinergica sia coinvolta nei processi cognitivi. In particolare, è stato proposto che la stimolazione dei recettori nicotinici α7 (α7-nAChRs), con agonisti selettivi o con modulatori allosterici positivi (PAM), possa rappresentare un possibile approccio terapeutico per diverse patologie neurologiche e psichiatriche. Tuttavia, nessun farmaco di questo tipo è ancora stato approvato per l’uso clinico. In questo studio, riportiamo che basse concentrazioni (picomolari) di  metillicaconitina (MLA), un antagonista selettivo dei α7-nAChRs, sono in grado di potenziare le riposte elettrofisiologiche di recettori α7-nAChRs umani e di convertire la long-term potentiation (LTP) ippocampale  dalla sua forma “early” (E-LTP) a quella “late” (L-LTP). Inoltre, la somministrazione intraperitoneale di basse dosi di MLA ha provocato l’aumento dei livelli extracellulari di glutammato, misurati nell’ippocampo con la microdialisi, ed ha migliorato la fase di acquisizione del processo di formazione della memoria nel test di riconoscimento dell’oggetto (ORT). Questi risultati possono sembrare sorprendenti se si pensa al noto effetto amnesico che hanno gli antagonisti dei recettori nicotinici, effetto che tuttavia si manifesta a dosi ben più alte. E’ ipotizzabile che basse dosi di MLA aumentino l’attività dei nAChRs riducendone lo stato di desensitizzazione od ottimizzando il legame dell’acetilcolina al recettore, così da massimizzare la stabilizzazione dell’apertura del canale ionico.

Questi risultati indicano che, oltre ad agonisti e PAM, anche gli antagonisti dei recettori nicotinici α7, ad opportuni dosaggi, potrebbero essere utili per il trattamento di patologie caratterizzate da deficit cognitivi come la malattia di Alzhemeir.

Rosenbrock H., Giovannini R., Schänzle G., Koros E., Runge F., Fuchs H., Marti A., Reymann K.G., Schröder U.H., Fedele E., Dorner-Ciossek C. (2019) The Novel Phosphodiesterase 9A Inhibitor BI 409306 Increases Cyclic Guanosine Monophosphate Levels in the Brain, Promotes Synaptic Plasticity, and Enhances Memory Function in Rodents. J. Pharmacol. Exp. Ther. 371(3):633-641

In questo articolo, il nuovo e potente inibitore della PDE 9A BI 409306 è stato caratterizzato dal punto di vista farmacologico in termini di potenza (IC50 di 65 e 168 nM rispetto a PDE9A umana e di ratto, rispettivamente) e selettività (rispetto a 9 diverse isoforme di PDE) e della sua capacità di aumentare il cGMP, in vitro e in vivo, e di potenziare l’LTP ippocampale, il substrato elettrofisiologico dell’apprendimento e della formazione della memoria. Inoltre, il farmaco ha dimostrato di revertire i deficit della memoria di lavoro nel test di alternanza T-maze in topi trattati con l’antagonista del recettore NMDA MK-801 e di migliorare la memoria episodica nei topi normali nel test di riconoscimento degli oggetti a 24 ore di distanza. Risultati preliminari sui pazienti con malattia di Alzheimer hanno mostrato che BI 409306 era ben tollerato ma non mostrava effetti significativi sui deficit cognitivi alle dosi impiegate.

Olivero G, Vergassola M, Cisani F, Usai C, Pittaluga A. (2019) Immuno-Pharmacological Characterization of Presynaptic GluN3A-Containing NMDA Autoreceptors: Relevance to Anti-NMDA Receptor Autoimmune Diseases. Mol Neurobiol. 56(9): 6142-6155.

Questo lavoro rappresenta la prosecuzione di studi precedenti dedicati alla caratterizzazione farmacologica degli autorecettori NMDA in ippocampo. Avevamo precedentemente dimostrato come sinaptosomi ippocampali esprimano le subunità GluN1, GluN2A, GluN2B e GluN3A in grado di associarsi per formare gli autorecettori NMDA (NMDAR, Musante et al., 2011, J Neurochem 117:516-527). La partecipazione delle subunità GluN1, GluN2A e GluN2B era stata supportata da studi funzionali con agonisti e antagonisti selettivi per queste subunità. La mancanza di ligandi selettivi per GluN3A, al contrario, non aveva permesso di confermare la presenza di questa subunità, sebbene alcuni dati suggerissero il suo coinvolgimento nell’espressione dei recettori NMDA. Per chiarire questo aspetto, abbiamo usato un approccio “immuno-farmacologico”, basato sull’utilizzo di anticorpi diretti contro la sequenza amino-terminale di selettive subunità recettoriali come “tools” specifici per evidenziare la partecipazione di una data proteina al complesso recettoriale. Attraverso questo approccio, abbiamo dimostrato che anche la subunità GluN3A è una componente importante degli NMDARs in terminali glutamatergici ippocampali. Il nostro studio ha anche dimostrato il coinvolgimento della subunità GluN1 priva della sequenza N1 in questi recettori. Questa subunità potrebbe consentire l’inserzione della proteina GluN3A nelle membrane sinaptosomiali, favorendone l’associazione al complesso eterodimerico GluN1/ GluN2A/ GluN2B. Abbiamo infine dimostrato come gli anticorpi anti-GluN riducano significativamente il rilascio di glutammato evocato dagli NMDARs in terminali nervosi ippocampali, favorendo un’internalizzazione dei recettori NMDA. Considerando il ruolo degli autoanticorpi anti-GluN nell’eziopatogenesi della psicosi, i nostri risultati aumentano la comprensione degli eventi cellulari che portano alla compromissione della plasticità sinaptica in pazienti che soffrono di alterazioni della psiche su base autoimmune.

Bonfiglio T, Olivero G, Vergassola M, Di Cesare Mannelli L, Pacini A, Iannuzzi F, Summa M, Bertorelli R, Feligioni M, Ghelardini C, Pittaluga A. (2019) Environmental training is beneficial to clinical symptoms and cortical presynaptic defects in mice suffering from experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuropharmacology.  145(Pt A):75-86.

Con i termini “arricchimento ambientale” (environmental enrichment, EE) si intende l’aggiunta di oggetti alle gabbie degli animali per aumentare i livelli di novità e complessità dell’ambiente in cui essi vivono. EE aumenta l’attività cognitiva e l’esercizio fisico spontaneo, potenziando la resilienza al danno cerebrale. È stato dimostrato che l’EE è neuroprotettivo nell’invecchiamento, nei disordini neurodegenerativi e nella malattia demielinizzante autoimmune. In particolare, l’esposizione precoce a EE era in grado di ridurre la gravità dei sintomi clinici negli animali con Encefalomielite Sperimentale Autoimmune (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE), un modello animale della sclerosi multipla. In questi animali EE aumentava anche la mobilizzazione delle cellule progenitrici neurali adulte nelle lesioni demielinizzate, favorendo la maturazione delle cellule staminali della zona subventricolare ad oligodendrociti (Magalon et al., 2007, Eur. J. Neurosci. 25, 761). Il nostro studio è stato dedicato a valutare l’impatto di un EE “profilattico” sui sintomi clinici e sui difetti presinaptici nei topi EAE allo stadio acuto della malattia (21 ± 1 giorni dopo l’immunizzazione, days post immunization, d.p.i. ) i dati hanno dimostrato come la gravità clinica sia ridotta nei topi EAE cresciuti in arricchimento ambientale (topi EE-EAE) rispetto ai topi EAE cresciuti in ambiente standard (SE-EAE). Inoltre, abbiamo osservato un aumento di peso, dell’attività motoria spontanea e della curiosità nei topi EE-EAE, a suggerire un aumentato benessere degli animali. La riduzione dell’esocitosi di glutammato e della produzione di cAMP che si osserva nei terminali nervosi corticali di topi SE-EAE era recuperata nei topi EE-EAE. Infine, gli infiltrati infiammatori erano ridotti nella corteccia di topi EE-EAE ma non nel midollo spinale, dove la demielinizzazione invece era significativamente ridotta rispetto ai topi SE-EAE. In conclusione, i nostri dati dimostrano come l’arricchimento ambientale “profilattico” abbia un effetto benefico sui difetti sinaptici e preservi la trasmissione glutammatergica nella corteccia degli animali EAE.

Fedele E., Ricciarelli R. (2018) cAMP, cGMP and Amyloid β: Three Ideal Partners for Memory Formation. Trends Neurosci. 41(5):255-266.

In questa review sono riassunte le principali evidenze scientifiche che dimostrano come i due nucleotidi ciclici cAMP e cGMP, classici secondi messaggeri intracellulari ma con importanti funzioni extracellulari, abbiano un ruolo fondamentale nei processi fisiologici che sono alla base della early e della late long-term potentiation e, quindi, dei meccanismi molecolari e cellulari necessari per la formazione della memoria a breve e lungo termine. Ma recenti risultati, ottenuti anche nei laboratori di ricerca degli autori, hanno evidenziato come livelli fisiologici del peptide beta amiloide (Aβ), più noto come uno dei responsabili della malattia di Alzheimer e dei deficit cognitivi ad essa associati, siano necessari proprio per la formazione e consolidamento della memoria, essendo Aβ l’effettore molecolare dell’attività promnesica del cAMP e del cGMP. Sulla base di questi nuovi dati, gli autori propongono una nuova ipotesi che vede nella perdita di funzionalità del peptide Aβ o nella sua ridotta disponibilità, e non nel suo accumulo, la possibile causa della malattia di Alzheimer.

Rebosio C*., Balbi M*., Passalacqua M., Ricciarelli R., Fedele E. Presynaptic GLP-1 receptors enhance the depolarization-evoked release of glutamate and GABA in the mouse cortex and hippocampus. Biofactors. 2018, 44(2):148-157. *equally contributed.

Il peptide glucagone-simile di tipo 1 (GLP-1) è un ormone noto da tempo svolgere un ampio numero di funzioni fisiologiche, soprattutto per la regolazione dell’omeostasi del glucosio, attraverso la stimolazione del suo recettore GLP-1R. Più di recente, è stato dimostrato che il sistema GLP-1/GLP-1R è presente anche a livello del Sistema Nervoso Centrale dove è coinvolto nella formazione e consolidamento della memoria, nonché in meccanismi che conferiscono ai neuroni protezione dalla morte cellulare. Tuttavia, poco si conosce degli effetti che questo sistema recettoriale ha sulla neurotrasmissione centrale. Utilizzando tecniche di immunofluorescenza e metodiche funzionali, in questo studio si è dimostrato come recettori GLP-1R sono presenti sui bottoni sinaptici di neuroni glutammatergici e GABAergici dove sono in grado di stimolare il rilascio esocitotico dei rispettivi trasmettitori attivando l’adenilato ciclasi, un effetto che era prevenuto dall’antagonista selettivo di tali recettori. La capacità di aumentare il rilascio di glutammato e GABA da parte di recettori presinaptici GLP-1 potrebbe, quindi, rappresentare uno dei meccanismi attraverso i quali il neurormone media effetti pro-mnesici e neuroprotettivi che potranno essere sfruttati per nuove terapie di malattie neurodegenerative, quali le malattie di Parkinson e Alzheimer.

Olivero G, Grilli M, Vergassola M, Bonfiglio T, Padolecchia C, Garrone B, Di Giorgio FP, Tongiani S, Usai C, Marchi M, Pittaluga A. (2018). 5-HT2A-mGlu2/3 receptor complex in rat spinal cord glutamatergic nerve endings: a 5-HT2A to mGlu2/3 signalling to amplify presynaptic mechanism of auto-control of glutamate exocytosis. Neuropharmacology, 133:429-439.

Benchè l’esistenza e il ruolo di autorecettori mGlu2/3 presinaptici siano ben documentati in letteratura, l’osservazione che questi recettori possano eterodimerizzare con recettori metabotropi non glutammatergici, ad esempio i recettori 5-HT2Anella corteccia dei mammiferi (Delille et al., 2012, Neuropharmacology 62, 2184) ha notevolemente incrementato la complessità di questo sistema recettoriale. Recentemente abbiamo dimostrato l’esistenza di autorecettori mGlu2/3 che controllano l’esocitosi di glutammato nelle terminazioni nervose di midollo spinale di ratto. Lo studio è poi proseguito valutando se tali terminali esprimano anche i recettori 5-HT2Ae se tali eterorecettori siano accoppiati funzionalmente agli autorecettori mGlu2/3. I risultati hanno dimostrato che i recettori mGlu2/3 e 5-HT2Acolocalizzano in questi terminali spinali dove sono legati da un “cross-talk” funzionale di tipo antagonistico. Infatti, il blocco dei recettori 5-HT2A con antagonisti selettivi determina un aumento dell’inibizione dell’esocitosi di glutammato mediata dai recettori mGlu2/3. L’aumento di funzionalità dei recettori mGlu2/3 è legato ad un’aumentata espressione della proteina recettoriale mGlu2/3 ed un loro aumentata inserzione in membrane sinaptosomiali. Questa osservazione è molto importante perché implica indirettamente: i) l’esistenza nei terminali spinali glutamatergici di recettori mGlu2/3 che possono essere rapidamente rilasciato in membrana; ii) il fatto che questi recettori siano in equilibrio dinamico con la riserva nei terminali nervosi; iii) il fatto che antagonisti per i recettori 5HT2Apossa controllare l’inserimento o l’allontanamento di questi recettori dalla membrana. Qualunque sia il meccanismo alla base di questi movimenti nelle membrane sinaptosomiali, le nostre osservazioni dimostrano per la prima volta che antagonisti 5-HT2Aagiscono da “modulatori allosterici positivi indiretti” degli autorecettori mGlu2/3 nel midollo spinale di ratto.